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Utilización de cepas de Bacteroides spp. como probiótico en conejos

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Cuando surgieron los antibióticos se consideró que eran la panacea de la salud; sin embargo, debido al uso intensivo, y en algunos casos al uso inadecuado que se ha hecho de ellos, ha hecho aparecer un gran problema como es el de las resistencias microbianas siendo necesario el descubrimiento de nuevos antibióticos o la implementación de medidas alternativas (Cotter et al., 2013; Hooper and Gordon, 2001; Lapeña, 1999). Como medidas alternativas, las más habituales están basadas en el uso de prebióticos, probióticos o la combinación de ambos (simbióticos), sin olvidar la necesaria implementación de medidas de bioseguridad, higiene y manejo...

Utilización de cepas de Bacteroides spp. como probiótico en conejos

A. Pérez de Rozas (1,2), J. González (2), N. Aloy (2), I. Badiola (1,2)

(1) Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries (IRTA), Barcelona, Spain.
(2) Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Bellaterra, Spain

INTRODUCCIÓN

Cuando surgieron los antibióticos se consideró que eran la panacea de la salud; sin embargo, debido al uso intensivo, y en algunos casos al uso inadecuado que se ha hecho de ellos, ha hecho aparecer un gran problema como es el de las resistencias microbianas siendo necesario el descubrimiento de nuevos antibióticos o la implementación de medidas alternativas (Cotter et al., 2013; Hooper and Gordon, 2001; Lapeña, 1999). Como medidas alternativas, las más habituales están basadas en el uso de prebióticos, probióticos o la combinación de ambos (simbióticos), sin olvidar la necesaria implementación de medidas de bioseguridad, higiene y manejo.

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PREBIÓTICOS Y PROBIÓTICOS

Los prebióticos son productos alimenticios no digeribles por el hospedador pero sí fermentables por algunos micoorganismos digestivos y que pueden provocar la estimulación del crecimiento o de la actividad de diferentes bacterias que producen efectos beneficiosos para la salud del hospedador (Fotiadis et al., 2008; Gibson and Roberfroid, 1995; Guarner and Malagelada, 2003; Markovic et al., 2009; Quigley, 2010; Tuohy et al., 2003). Generalmente permiten cambios tanto en la composición como en la actividad de la microbiota digestiva, incrementando la salud intestinal (Hedin et al., 2007). Afectan al hospedador estimulando selectivamente el crecimiento y la actividad de una o varias bacterias del colon (Kaur et al., 2009).

Los probióticos son microorganismos vivos, cuya ingestión en cierto número produce efectos beneficiosos no inherentes a la nutrición normal (FAO/WHO, 2002; Fotiadis et al., 2008; Gorbach, 2002; Guarner and Malagelada, 2003; Isolauri et al., 2004; Nomoto, 2005; Quigley, 2008; Tuohy et al., 2003). Para ser considerado como probiótico, el microorganismo necesita sobrevivir, y multiplicarse, en el tracto gastrointestinal, por lo que debe adaptarse al medio ácido y a las sales biliares (van de Guchte et al., 2012).

En la práctica de campo, frecuentemente se administra la combinación de ambos, productos conocidos como simbióticos (Fotiadis et al., 2008; Hedin et al., 2007; Quigley, 2010; Tuohy et al., 2003).

MICROBIOTA

Realmente no somos conscientes de que, en condiciones fisiológicas, los diferentes seres vivos somos, la asociación de nuestra propia fisiología con la fisiología de un enorme número de microorganismos. Estos microorganismos forman la microbiota endógena. Esta simbiosis adquiere su máximo exponente en el sistema digestivo, con la microbiota intestinal.

Desde el nacimiento hasta la muerte, el hospedador es colonizado por un vasto, complejo y dinámico consorcio de microorganismos (Tuohy et al., 2003). La relación entre la microbiota y el hospedador puede derivar de comensalismo a patogenicidad, dependiendo de las cepas de microorganismos y de las condiciones fisiológicas del animal, y también puede producirse una disminución de la tolerancia del hospedador a ciertos microorganismos de su microbiota (Hooper and Gordon, 2001), intolerancia que puede provocar inflamación intestinal crónica seguida de importantes alteraciones metabólicas (Pakandl, 2009).

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Bacteroides spp.

Nuestro grupo trabaja a menudo con granjas de conejos y sabemos la problemática que tienen en cuanto a enfermedades digestivas y el uso que se hace de los antibióticos, por lo que hemos hecho el estudio sobre esta especie.

La relación entre la microbiota y el hospedador puede derivar de comensalismo a patogenicidad, dependiendo de las cepas de microorganismos y de las condiciones fisiológicas del animal

En cuanto a la especie de la microbiota para utilizar como probiótico se necesita escoger una especie adecuada y métodos que muestren las diferencias entre cepas de la misma especie para ver cuáles son las más útiles. Nosotros escogimos especies de Bacteroides spp.

El interés de nuestro grupo en centrar el foco de atención en Bacteroides spp. fue el resultado de experimentos previos sobre animales con Enteropatía Epizoótica del Conejo (EEC) en los que pudimos comprobar que la administración, bien en el momento del destete bien en el momento del inicio de la sintomatología, de diferentes cepas de Bacteroides fragilis provocaban la reducción del 50% en la tasa de mortalidad en relación con la observada en los grupos de animales que no recibieron las cepas de B. fragilis.

Los Bacteroides spp. se encuentran en el intestino en recuentos de hasta 1011 cfu/g heces, son capaces de colonizar el colon, la cavidad oral, el tracto respiratorio superior y el tracto genital femenino. B. fragilis tiene un polisacárido capsular (PSA) que interviene en la colonización y que además participa en la maduración del sistema inmune asociado a la mucosa intestinal. Producen también bacteriocinas que tienen actividad antimicrobiana y que son muy estables.

PRUEBAS IN VITRO

Para obtener un producto probiótico lo más importante es la selección de la cepa o cepas que se incluirán en él. Este fue el objetivo principal de este trabajo.

Basándonos en la colección de Bacteroides spp. del CReSA, en este trabajo se han realizado estudios in vitro para seleccionar cepas, con ausencia de características negativas y presencia de características positivas, que pudieran utilizarse en estudios in vivo, en gazapos durante la fase de lactación, y poder analizar su rol como posible probiótico. De esta colección se seleccionaron 97 cepas para estudiar sus características y así ir seleccionando unas cepas e ir desechando otras.

Los Bacteroides spp. podrían tener actividad probiótica por dos mecanismos diferentes: bien produciendo sustancias inhibidoras del crecimiento de otros componentes de la microbiota intestinal (bacteriocinas, metabolitos secundarios…), bien estimulando al sistema inmune, incrementando las defensas de forma inespecífica (inmuno-moduladores).

Pruebas:

  • producción de sustancias inhibidoras del crecimiento
  • presencia de PSA y grado de expresión
  • perfiles de antibióticos
  • detección de genes de resistencia a antimicrobianos
  • presencia de secuencias de inserción
  • sensibilidad a coccidiostáticos
  • presencia de mucinasa y grado de expresión
  • detección genes de enterotoxinas

Nº de cepas incluidas en el estudio: 97

  • B. fragilis 29
  • B. thetaiotaomicron 29
  • B. acidifaciens 25
  • B. vulgatus 5
  • B. xylanosolvens 3
  • B. dorei 2
  • B. massilliensis 2
  • B. intestinalis 1
  • B. fluxus 1

La producción de sustancias inhibidoras del crecimiento fue un factor importante a estudiar. En la mayoría de muestras de granjas con EEC, nuestro grupo observó un incremento significativo de Bacteroides spp. en los animales afectados, un signo que consideramos forma parte de los factores asociados a la patogenia de la enfermedad y que podría explicar el efecto positivo de algunas cepas de Bacteroides fragilis en la reducción de las tasas de mortalidad de los animales con EEC.

Se usaron técnicas de bacteriología para estudiar las resistencias a antimicrobianos y a cocidiostáticos. La resistencia a antimicrobianos fue el factor determinante de la elección de ciertas bacterias sobre otras.

Para estudiar producción de PSA y su grado de expresión, las secuencias de inserción, la detección de genes de resistencias y la producción de mucinasa y su grado de expresión se utilizaron técnicas moleculares: extracción de DNA y RNA, y se hicieron PCR, Real Time-PCR.

Con los resultados obtenidos por la producción de sustancias inhibidoras del crecimiento, producción de PSA y una primera serie de antibiogramas, se eliminaron muchas de las cepas y pasamos a tener 20.

Después se estudiaron todos los resultados y escogimos cuatro de las cepas estudiadas: CV-183, CV-293, CV-315, CV-607.

PRUEBAS IN VIVO

Después de seleccionar cuatro cepas, se procedió al estudio in vivo, en una granja comercial, examinando el efecto sobre la microbiota intestinal y diferentes parámetros inmunitarios de la mucosa intestinal. Se incluyó también un grupo control negativo (no contenía ningún Bacteroides).

En cuanto a la microbiota intestinal, no hubo cambios significativos en el perfil global y se observó que el efecto de la madre fue muy superior al efecto de la cepa inoculada. De este resultado pudo inferir que, como ya habíamos comprobado en otras pruebas, la microbiota de la madre determina claramente la microbiota de los gazapos.

No obstante lo anterior, los recuentos de Bacteroides spp. en el contenido cecal de los animales a los que se les administraron las cepas CV-183, CV-293 o CV-315 tuvieron recuentos significativamente inferiores al control negativo y a los que recibieron la cepa CV-607. Este hallazgo es de capital importancia y puede explicar la reducción de las tasas de mortalidad que ya habíamos observado por la inoculación de la cepa CV-315 a animales con EEC.

El efecto obtenido sobre marcadores inmunitarios de la mucosa intestinal, en unos casos con niveles de expresión inferiores al control negativo (citoquinas proinflamatorias) y en otros superiores (marcadores de superficie relacionados con la presentación de antígenos vía MHC II), nos indica entre otras cosas que un buen probiótico debería constar de más de una cepa.

Adicionalmente, en este trabajo hemos podido ver que la administración de las cepas CV-183 y CV-315 provocaron el aumento significativo del grado de maduración de los fragmentos génicos que formarán parte de las inmunoglobulinas, preparando al sistema inmunitario asociado a la mucosa intestinal para responder mejor a futuras agresiones de tipo infeccioso o no infeccioso. El incremento en el grado de variabilidad de las inmunoglobulinas observado representa un cambio positivo para las fases posteriores de producción.

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Fig. 2. Proceso de la prueba in vivo: inoculación intragástrica de cada cepa a 10 gazapos de 2 hembras. Sacrificio y necropsia a día 28. Extracción de DNA en alcohol y de RNA en RNA-later para las analíticas posteriores.

Tabla 1. Nº de cepa, la especie de Bacteroides a que corresponde, el antibiótico probado y su resultado en categorías sensible (S), intermedio (I) y resistente (R) según el CLSI. (GEN=gentamicina, TCY=tetraciclina, TYL=tilosina, AMX=amoxicilina, TIO=ceftiofur, RIF=rifampicina, COL=colistina NAL=ácido nalidíxico, CHL=cloranfenicol, LIN=lincomicina, ERI=eritromicina, PEN=penicilina, BAC=bacitracina, NIT=nitrofurantoina, ENR=enrofloxacina, SUL=sulfonamida, FOS=fosfomicina, CLI=clindamicina, TEC=teicoplanina).

Cepa

Especie

GEN

TCY

TYL

AMX

TIO

RIF

COL

NAL

CHL

LIN

ERI

PEN

BAC

NIT

ENR

SUL

FOS

CLI

TEC

CV-0130

B. thetaiotaomicron

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CV-0183

B. dorei

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CV-0232

B. fragilis

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CV-0268

B. thetaiotaomicron

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CV-0293

B. fragilis

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CV-0294

B. fragilis

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CV-0295

B. fragilis

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CV-0309

B. thetaiotaomicron

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CV-0315

B. fragilis

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CV-0323

B. fragilis

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CV-0325

B. fragilis

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CV-0350

B. acidifaciens

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CV-0357

B. acidifaciens

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CV-0375

B. acidifaciens

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CV-0376

B. acidifaciens

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CV-0378

B. fragilis

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CV-0393

B. fragilis

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CV-0464

B. acidifaciens

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CV-0466

B. fluxus

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CV-0607

B. acidifaciens

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I

I

I

S

I

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CONCLUSIONES

Para realizar estudios de este tipo se plantea la necesidad de contar con granjas donde no se utilicen antimicrobianos, para crear ceparios de bacterias intestinales sin marcadores de resistencia.

Las cepas CV-0183, CV-0293 y CV-0315 activaron funciones relacionadas con la presentación de antígenos vía MCH II y redujeron la expresión de algunos genes de citoquinas proinflamatorias. Además estas cepas fueron capaces de reducir el recuento de Bacteroides spp.en el ciego de los animales tratados.

La cepa CV-607 presentó un comportamiento in vivo diferente a las cepas CV-0183, CV-0293 o CV-0315 y, por lo general, similar al control negativo.

De los resultados obtenidos podemos inferir que algunas de las cepas probadas, CV-0183, CV-0293 y CV-0315, pueden ser candidatos para el desarrollo de un probiótico para conejo, especialmente para controlar EEC, aunque será importante analizar también su papel sobre otras infecciones del sistema digestivo del conejo.

BIBLIOGRAFÍA

Se enviará a quienes la soliciten. •