La nueva enfermedad hemorrágica del conejo

Francisco Parra y Kevin P. Dalton

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.
Instituto Universitario de Biotecnología de Asturias. Universidad de Oviedo
38 º Symposium de Cunicultura de ASESCU

La difícil situación actual de la cunicultura española, debida a una conjunción de factores socio-económicos, se ha visto agravada en el último año por la irrupción de una variante del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV) que está poniendo en serio riesgo la supervivencia de muchas explotaciones. Ante esta situación INTERCUN, a través de la extensión de norma, está impulsando las investigaciones realizadas en la Universidad de Oviedo para conocer las causas y extensión de la enfermedad, apoyando a los productores y técnicos sanitarios facilitando el diagnóstico de los brotes de RHD y promoviendo el desarrollo de una nueva vacuna que permita el control de esta patología.

Evolución de la enfermedad

La enfermedad hemorrágica del conejo (RHD) se detectó en España por vez primera a finales de los años 80 del siglo pasado. Este proceso infeccioso, hasta entonces desconocido, pudo controlarse relativamente pronto en las explotaciones cunícolas españolas gracias al desarrollo de vacunas inactivadas que mostraron ser muy eficaces para prevenir y combatir los brotes de RHD. Tras los grandes daños económicos producidos inicialmente por la RHD en la cunicultura, la eficacia de las vacunas y la poca variabilidad antigénica de los virus circulantes han permitido que esta enfermedad tuviese un impacto reducido y controlado en los últimos 20 años.

En 2011 empezaron a detectarse algunos casos “atípicos” de enfermedad hemorrágica (RHD) en granjas de Navarra (Dalton y col, 2012), Aragón (Grasa, J.R. y Malo, M. 2012), y Cataluña así como en una población experimental de conejos silvestres en Aragón (Calvete y col. 2012). En muchas de las granjas afectadas se realizaba una correcta vacunación y se observó que los mayores índices de mortalidad se producían en los gazapos menores de 50 días, un rango de edad en el que los conejos no son susceptibles al RHDV conocido hasta entonces. Estas circunstancias y el aumento progresivo de los casos atípicos de RHD en gazapos impulsaron a INTERCUN a promover nuestras investigaciones que se centraron inicialmente en caracterizar el virus responsable de esta nueva patología. A lo largo del 2012 hemos podido observar la rápida progresión de los casos de RHD variante que han llegado a nuestro laboratorio (Figura 1). Los análisis realizados no responden a un muestreo sistemático diseñado para investigar la epizootiología de la RHD en España sino que son el resultado de la iniciativa individual de muchos técnicos que nos han remitido muestras de brotes sospechosos de RHD para su diagnóstico en el laboratorio.

No obstante, el número y localización de las muestras recibidas puede tomarse como un indicador bastante aproximado de la intensidad y dispersión de los casos de RHD variante en nuestro país. Los casos iniciales afectaban casi exclusivamente a explotaciones del noreste peninsular, apoyando la hipótesis de que el virus responsable pudiera estar emparentado con los causantes de brotes similares reportados en Francia en 2010 (Le Gall-Reculé y col. 2011). Hoy día podemos considerar que la enfermedad debida al RHDV variante se ha extendido por toda la Península Ibérica.

Durante el último año se han analizado, con técnicas inmunológicas y genéticas, varios cientos de muestras individuales de tejidos de conejos sospechosos de padecer la RHD, de más de 60 explotaciones cunícolas, distribuidas por 17 provincias españolas y en el norte de Portugal. Los resultados diagnósticos de nuestro laboratorio y los publicados por otros investigadores (Calvete y col. 2012) indican que el virus RHDV clásico, que solía ser el responsable de los casos de RHD detectados antes de 2011, está siendo reemplazado por la cepa variante, que es el agente responsable de la abrumadora mayoría de los casos diagnosticados en España en el 2012, tanto en animales domésticos como silvestres.

Nos atrevemos a aventurar que el desplazamiento del virus clásico por la cepa variante no es únicamente debido a una posible mayor aptitud genética y adaptativa del RHDV variante sino, muy probablemente, el resultado de la gran presión vacunal ejercida sobre la cepa clásica. En términos prácticos, la vacunación intensiva ha hecho descender al mínimo los casos de RHD debidos al virus clásico y facilita que se imponga la cepa variante que posee diferencias estructurales que le permiten escapar a las vacunas comerciales actuales.

El nuevo virus de la enfermedad hemorrágica.

Los primeros análisis de los casos ocurridos en 2011 en granjas de Navarra permitieron detectar en los tejidos de los gazapos analizados la presencia de un tipo de virus más cercano genéticamente a los virus no patógenos de conejo, denominados “calicivirus del conejo” que al RHDV. Estos virus atenuados “RCVs” habían sido descritos varios años antes en distintos países europeos pero no en la Península Ibérica. La presencia de un agente infeccioso en los órganos de un animal enfermo o muerto no es una prueba suficiente para afirmar que es el agente causal del proceso. Para demostrar la naturaleza patógena de este nuevo virus y su capacidad para producir la enfermedad hemorrágica descrita en las granjas se realizó una infección experimental de conejos adultos (más de 60 días) y gazapos (30 días) utilizando el virus purificado a partir del hígado de un gazapo muerto en una explotación de Navarra. Esta prueba realizada en diciembre de 2011 permitió reproducir la enfermedad tanto en adultos como en gazapos y constatar que los signos clínicos de los animales muertos tenían las mismas características que los observados en el campo.

Adicionalmente pudo también comprobarse la presencia del virus en el epitelio intestinal de los animales infectados (Figura 2), una localización en la que no suele encontrarse el RHDV clásico. Estos y otros estudios permitieron caracterizar este aislado denominado RHDV-N11 como una variante del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo.

Otros estudios complementarios realizados en el laboratorio permitieron demostrar que el RHDV-N11 poseía una estructura y propiedades diferenciadas, tanto en la reacción con anticuerpos específicos como en su capacidad de interacción con los carbohidratos de los grupos sanguíneos, que permitían su distinción de las cepas clásicas del RHDV. Estas características podían correlacionarse con la aparente falta de eficacia de las vacunas y con la capacidad del nuevo virus para afectar a gazapos menores de 2 meses, a diferencia de las cepas clásicas del RHDV. Todas estas investigaciones financiadas por INTERCUN se han publicado de forma más detallada en una revista especializada en enfermedades emergentes (Dalton y col. 2012).

Hacia una nueva vacuna contra el RHDV variante

Ante la aparente falta de eficacia de las vacunas actuales se han iniciado distintos estudios para desarrollar una nueva vacuna capaz de neutralizar al virus RHDV-N11 en las granjas españolas.

Con objeto de valorar la potencia infectiva de los extractos de tejidos que contenían el aislado RHDV-N11 se realizaron nuevos experimentos de desafío en una granja experimental del INTIA (Guirguillano. Navarra). Se emplearon dos lotes de 10 conejos de 30 días de edad que fueron infectados experimentalmente por vía intramuscular con 10000 UA (la aglutinación se realizó utilizando glóbulos rojos humanos del grupo B) o con 1000 UA de extracto infeccioso conteniendo RHDV-N11. Se mantuvo un tercer lote de 5 animales no infectados como control. El seguimiento de los animales retados tanto con la dosis alta como con la dosis baja de RHDV permitió observar una mortalidad significativa a partir de las 24 h siguientes al desafío (Figura 3), alcanzando tasas del 50 al 55% trascurridas 72 horas de la infección (Figura 3).

Los resultados obtenidos muestran que una cantidad de extracto de hígado conteniendo 1000 UA de RHDV-N11 es suficiente para reproducir experimentalmente tasas de mortalidad similares a las observadas en las granjas en conejos de la misma edad infectados de modo natural. Considerando que el uso de una cantidad 10 veces mayor de virus dio lugar a un nivel de mortalidad similar a la dosis menor (Figura 3) puede estimarse que la DL50 (dosis letal media) de RHDV-N11 será una cantidad igual o inferior a 1000UA. Estas cantidades de virus se tomaran posteriormente como referencia para realizar desafíos a la hora de valorar la protección de futuras vacunas.

Con objeto de demostrar la eficacia de una vacuna experimental contra la RHD variante, se diseñó un experimento para administrar el RHDV-N11 previamente inactivado químicamente con b-propiolactona (BPL) y retar posteriormente a los animales vacunados con el virus patógeno. Esta prueba fue realizada por el personal y en las instalaciones del Animalario del Laboratorio Central Veterinario (LCV) de Algete.

Se organizaron 5 grupos de animales, cuatro de ellos con 12 conejos y el quinto con 5 animales. Al inicio del experimento los animales se trasladaron al LCV cuando tenían 22 días de edad. Tras su aclimatación, y una vez comprobado mediante ELISA que no tenían anticuerpos frente al RHDV, dos grupos de 12 conejos (1 y 3) se vacunaron (27 días de edad) por vía intramuscular en una pata trasera con una cantidad de virus equivalente a 10000UA de virus RHDV-N11 inactivado con BPL. Otros dos grupos de animales (2 y 3) se inyectaron con suero salino (placebo) y los 5 animales restantes se alojaron en otro compartimento separado como controles. Los animales de los grupos 1 y 2 por un lado y los de los grupos 3 y 4 por otro se alojaron en dos compartimentos separados del LCV. A los 7 días después de la vacunación, se tomaron muestras de sangre para evaluar el nivel de anticuerpos frente al RHDV en los animales del grupo 1 (vacunados) y 2 (no vacunados) y a continuación se desafiaron con 1000 UA de RHDV-N11 mediante inyección intramuscular. La edad de los animales en el momento del reto era de 34 días. Pudo constatarse que, a pesar de que ninguno de los animales de los grupos 1 y 2 tenían niveles de anticuerpos dentro del rango de la positividad del test ELISA, todos los componentes del grupo 1 (vacunados) sobrevivieron al menos 7 días después del desafío mientras que 5 animales del grupo 2 (no vacunados) murieron antes de las 72 horas mostrando signos de enfermedad hemorrágica (Figura 4). En todos los casos pudo detectarse la presencia de antígeno y genoma viral en muestras de hígado de los animales muertos. No se detectó la presencia de virus en el hígado de los animales sobrevivientes que fueron sacrificados 7 días después del desafío.

Los resultados obtenidos demuestran que la vacunación experimental con el propio virus RHDV-N11 inactivado con BPL tiene una eficacia del 100% a la hora de proteger gazapos frente a un reto virulento con el RHDV variante.

A los 15 días de la vacunación se tomaron muestras de sangre de los animales del grupo 3 (vacunados) y 4 (no vacunados) y a continuación se desafiaron con 1000 UA de RHDV-N11 mediante inyección intramuscular. La edad de los animales en el momento del reto era de 42 días. Pudo constatarse que el 50% de los animales del grupo 3 (vacunados) tenían niveles de anticuerpos dentro del rango de la positividad del test ELISA, mientras que todos los componentes del grupo 4 (no vacunados) eran negativos. Todos los conejos del grupo 3, menos uno, sobrevivieron al desafío con RHDV-N11 al menos 7 días después del reto. El animal muerto en el grupo de vacunados mostraba una patología digestiva y deshidratación desde al menos 9 días antes del desafío y murió por otras causas no relacionadas con la RHD. Tras la necropsia no se encontró antígeno viral en el hígado de este animal. En el grupo 4 (no vacunados) murió un solo animal antes de las 72 horas mostrando signos de enfermedad hemorrágica y con presencia del antígeno vírico en el hígado. No se detectó la presencia de virus en el hígado de los 11 animales sobrevivientes del grupo 3 (vacunados) que fueron sacrificados 7 días después del desafío. Uno de los animales sobrevivientes del grupo 4 tenía niveles detectables de antígeno del RHDV en el hígado, mediante ELISA de captura. No obstante no puedo detectarse en genoma viral mediante RT-PCR. El nivel de mortalidad en este grupo experimental (1/12) de animales no vacunados fue de un 8,3%.

Aunque la mortalidad debida al RHDV variante en este rango de edad es más baja, la eficacia de la vacuna permitió la supervivencia de todos los animales vacunados con el RHDV-N11 inactivado.

Conclusiones

El estudio de centenares de casos de RHD diagnosticados en la Universidad de Oviedo durante el 2012 muestra que el RHDV variante (similar al RHDV-N11) es el responsable mayoritario de los brotes analizados (> 96%) tanto en las explotaciones ganaderas como en los conejos silvestres analizados. Esta situación se mantiene, a pesar del (o tal vez debido al) uso masivo de las vacunas disponibles lo que sugiere una falta de eficacia de las vacunas empleadas frente a la nueva variante del RHDV.

En la situación actual, mientras no se disponga de una vacuna específica frente a la nueva variante es necesario mantener unas medidas de higiene, control de insectos y bioseguridad estrictas para intentar reducir la circulación del virus RHDV variante. Teniendo en cuenta la resistencia a la inactivación de este virus debe extremarse la limpieza y desinfección de vehículos, controlar el acceso a las explotaciones y limitar el movimiento de personas y materiales que contribuyan a dispersar el virus.

Los análisis realizados hasta el momento indican que los gazapos menores de 40 días son la población más sensible al RHDV variante, con índices de mortalidad de hasta el 60%. Los conejos adultos tienen tasas de mortalidad muy inferiores entre el 5 y el 10%.

Las pruebas de inmunización realizadas demuestran que una vacuna inactivada del RHDV-N11 es capaz de proteger eficazmente al 100 % los conejos vacunados a partir de los 7 días de la vacunación.

Considerando todo lo anterior, es urgente desarrollar y poner en el mercado esta nueva vacuna basada en el RHDV-N11 inactivado como único modo factible de controlar los brotes de la nueva enfermedad hemorrágica tanto en los conejos domésticos como en los silvestres. Una vez que se realicen estudios de protección cruzada con el RHDV clásico será necesario considerar la necesidad de mantener una profilaxis vacunal, separada o conjunta, frente a los dos tipos de RHDV dada su capacidad de afectar diferencialmente a conejos de distintas edades.

Agradecimientos:

Los autores quieren dejar constancia de su agradecimiento a INTERCUN, a todos los colaboradores de la Universidad de Oviedo, INTIA (Navarra) y LCV, así como a todos los técnicos y ganaderos que han contribuido a la realización de estas investigaciones.

Bibliografía:

• Calvete, C. Calvo, J.H. y Sarto, P. (2012) Detección de una nueva variante del virus de la enfermedad hemorrágica en conejos silvestres en España. 37º Simposium de cunicultura de ASESCU. Barbastro 23-25 Mayo 2012. pp 112-115.
• Dalton, K.P. Nicieza, I. Balseiro, A. Muguerza, M. Rosell, J.M. Casais, R. Álvarez, Á.L. and Parra, F. (2012). Variant Rabbit Hemorrhagic Disease Virus in Young Rabbits, Spain. Emerg. Infect. Dis. 18(12):2009-12.
• Grasa Albajar, J.R. y Malo Martínez, Mario. (2012) Enfermedad Vírica-Hemorrágica: nueva variante. 37º Simposium de cunicultura de ASESCU. Barbastro 23-25 Mayo 2012. pp 8-35.
• Le Gall-Reculé G, Zwingelstein F, Boucher S, Le Normand B, Plassiart G, Portejoie Y, et al. Detection of a new variant of rabbit haemorrhagic disease virus in France. Vet Rec. 2011;168:137–8